中文摘要：

红细胞膜骨架的六边形网格结构是其变形的基础，但人们对该结构形成的调节，特别是生物力学因素的调节尚不清楚。预实验显示，膜骨架蛋白-原肌球调节蛋白1（Tmod1）的双启动子在有核红细胞中受流体剪切力调控，引起其同源异构体的不同表达。据此提出假说流体剪切力通过剪切力反应转录因子调节Tmod1启动子活性，驱动Tmod1同源异构体的差异表达，对细胞膜骨架的形成发挥不同作用。为验证假说，将对有核红细胞进行剪切力处理，观察Tmod1基因表达；利用点突变和凝胶迁移滞后等实验鉴定调控Tmod1启动子的剪切力反应元件；利用信号通路抑制剂处理细胞，找到剪切力调控Tmod1的信号传导通路；利用腺病毒过表达和小RNA干扰，结合微吸管等生物力学技术，研究Tmod1同源异构体在膜骨架形成中的作用及对细胞力学特性的影响。本课题将建立生物力学因素与红细胞膜骨架形成之间的联系，并为基于造血干细胞的血液疾病的治疗提供新思路。

结论摘要：

流体剪切力能促进胚胎期造血的发生，但其对红细胞分化和细胞骨架重构的作用和机制仍不清楚。本项目研究红细胞原肌球蛋白调节蛋白（E-Tmod）的同源异构体在流体剪切力引起的有核红细胞F-actin细胞骨架重构中的作用机制。采用小鼠红白血病（MEL）细胞和小鼠胚胎成红细胞进行流体剪切力（5 dyn/cm2）处理。瑞氏染色结果表明，剪切后的MEL和成红细胞都出现了向成熟红细胞分化的趋势。流式细胞仪和激光共聚焦结果显示，剪切的MEL细胞中F-actin骨架的含量增加。实时定量PCR和Western blot结果显示，剪切后的MEL和成红细胞中，E-Tmod41的表达增加，而E-Tmod29的表达降低。当过表达或敲低E-Tmod41时，MEL细胞中F-actin细胞骨架的含量显著升高或降低。我们分别从microRNA和启动子活性两方面探讨了流体剪切力对E-Tmod同源异构体表达调控的机制。microRNA芯片分析显示，流体剪切力引起了429个microRNAs发生>1.5倍的改变，其中22个microRNAs变化显著。生物信息学预测显示miR-23b-3p是小鼠E-Tmod41的靶向microRNA，而荧光素酶活性分析也证实其确实靶向E-Tmod41 3’UTR。芯片和实时定量PCR结果显示，流体剪切力能降低miR-23b-3p及其宿主基因的表达。利用miR-23b-3p的mimic和inhibitor能分别降低和增加MEL细胞内E-Tmod41的蛋白表达，并引起F-actin骨架含量的改变，然而miR-23b-3p不影响E-Tmod29的表达。另外，荧光素酶活性分析显示，流体剪切力显著增加E-Tmod41的启动子PE0的活性，而降低E-Tmod29的启动子PE1的活性。上述结果提示，流体剪切力能够促进有核红细胞的分化并引起F-actin细胞骨架的重构；流体剪切力对有核红细胞中E-Tmod同源异构体具有不同的调控，而E-Tmod41表达的改变能引起F-actin细胞骨架的重构；流体剪切力能通过对miR-23b-3p的抑制和改变启动子活性两条途径调节E-Tmod同源异构体的表达。本课题的研究使我们对红细胞分化的调控因素有更深入的理解，并为红细胞成熟过程中发生的细胞骨架重构提供新的分子机制。