(1)以pBluescript KS II等3个质粒为过渡质粒,经过一系列的修饰、剪切和连接过程,将经典真菌表达质粒pCambia 1301 35S中正反向两个CaMV 35S启动子替换成GPD启动子,将CaMV 35S终止子替换为TrpC终止子,将GUS基因以GUS小片段替换,并在GUS小片段两侧分别插入酪氨酸酶基因铜离子结合位点(TYE-Cu2+)的正反义序列,最终形成以pCambia 1301 35S为基础的、由GPD启动的、通过大的发卡结构实现干涉功能的RNA干涉载体。将该载体转入农杆菌,侵染双孢蘑菇菌褶,经潮霉素筛选得到疑似转化子46株,经PCR验证为阳性。疑似转化子在不含潮霉素的平板上,生长速度亦明显慢于野生型,认为是RNA干涉元件发挥显著作用,影响了蘑菇菌丝的正常生长,进一步的遗传学分析在继续进行中。(2)设计同源引物,克隆了4条酪氨酸酶基因的cDNA序列,结合其它物种的相关信息,对该基因家族作了系统的生物信息学分析。(3)分别测定了双孢蘑菇菌柄、菌褶、菌盖内缘、菌盖内部、菌盖外缘等组织的酪氨酸酶酶活,结果显示在0.05水平,菌盖外缘的酶活显著高于其它组织。
英文主题词Agaricus bisporus; tyrosinase; RNA interference; gene family; enzyme activity