中文摘要：

近两年在《自然》《科学》等国际权威杂志大量报道了siRNA有诱导基因沉默的作用，我们近期实验结果也证明复制缺损型HBV载体能携带外源基因并正确包装。本课题拟先构建适合高效表达siRNA并高效包装的新型HBV载体，对表达野生型HBV的质粒修饰，使其不表达除P蛋白外的其它蛋白，逐段删除部分C基因区，插入H1启动子及靶向GFP的发卡状siRNA，证明其对GFP表达的抑制作用，并筛选出一个包装效率最优者，删除其siRNA，作为HBV载体；设计10个靶向HBV保守序列的siRNA，先在细胞水平观察其抑制HBV复制的作用；以EB病毒载体表达野生型HBV，用水动力学方法转染裸DNA，构建新型HBV感染大鼠模型，用共转染法在动物体内观察抗HBV疗效、重组HBV的形成及毒性反应。利用野生型HBV为载体提供包装，分泌抗HBV的HBV样颗粒，实现导向性及放大效应，为临床抗HBV治疗探索一条一次性廉价疗法新途径。

结论摘要：

RNA干扰具有强效的基因沉默功能，但尚缺乏理想的向细胞内转运的工具，本研究构建乙肝病毒（HBV）载体表达发夹状siRNA (shRNA) 用于抑制HBV复制。设计了14个理论靶位点，构建shRNA表达质粒并与表达HBV的质粒共转染肝癌细胞，筛选出有效的抗HBV靶位。经过对HBV表达质粒的核心蛋白区和表面抗原区系列删除，并分别插入靶向绿色荧光蛋白的shRNA表达单元，与辅助质粒共转染肝癌细胞，经过多步骤筛选出高复制能力的HBV-shRNA双表达载体，证实其能够形成完整的HBV颗粒，且只能依赖辅助病毒复制。在这一载体上插入抗HBV有效的靶序列shRNA后，先在细胞水平证实了其抑制HBV复制和抗原表达的作用。进一步把这一载体插入腺病毒载体，利用腺病毒感染HBV转基因小鼠，证明了其对HBV复制和对乙肝表面抗原、核心抗原表达的抑制作用。本研究应用腺病毒载体转导HBV载体表达小干扰RNA，在体内利用野生型HBV 为之提供包装，分泌抗HBV 的HBV 样颗粒，实现导向性及放大效应，克服了大剂量应用腺病毒的毒性作用和不能重复应用的缺陷，有望为临床抗HBV 治疗开辟一次性廉价疗法新途径。