中文摘要：

Harpins是由革兰氏阴性植物病原细菌III型泌出系统分泌的蛋白，是一类非专化性激发子，能诱导烟草等非寄主产生过敏性反应（hypersensitive response，HR）。水稻白叶枯病菌harpin蛋白N-端的卷曲螺旋（coiled-coil，CC）能激发烟草产生HR，是重要的功能结构单位。本项目以含有CC区域的多肽N21为研究载体，明确CC在harpin抗病中的作用，在分子结构上为harpin的抗病机制提供新的解释；以及利用CC的结构特征筛选和分析N21在植物上的受体物质。本项目拟使用转基因技术，将肽转入烟草植株，探讨转入肽引发的植物信号传导通路、防卫反应相关基因表达等情况；拟使用亲和色谱等技术筛选植物细胞壁、细胞质膜和质外体液中与多肽N21互作结合的受体物质。本项目的实施，将为harpin的抗病分子机制提供新的理论解释，也将为harpin-植物互作机制的研究提供有效途径。

结论摘要：

水稻白叶枯病菌hpa1Xoo基因编码的Hpa1Xoo蛋白具有其它harpin蛋白所共有的生物活性，能激发烟草产生过敏性坏死反应（HR），诱导植物抗病、抗虫，促进植物生长。Hpa1Xoo蛋白N-端的卷曲螺旋（CC）结构域多肽片段N21具有激发烟草产生HR的活性，但在植株体内该多肽的抗病功能、机制及互作分子尚不明确。为进一步明确其功能和作用受体，本文通过转基因技术研究了CC多肽N21在烟草体内表达引发的抗病作用及其机理，利用CC的结构特征筛选和分析了N21在植物上的受体物质。本研究构建了重组转基因载体DH5α/pBI121∷N21，经测序验证后，采用冻融法转化根癌土壤杆菌EHA105菌株，再采用叶盘法转化三生烟草，获得转基因烟草植株。在转基因烟草的gDNA中可检测到目的基因序列，说明hpa1Xoo-N21已经整合到烟草基因组中，同时也能在转录水平正常表达。转基因烟草植株的株高、叶片大小及花期等性状与对照组烟草并无明显差异，生长发育正常。无肉眼可见的HR，但经台盼蓝染色后，光学显微镜下可见micro-HR。转基因烟草的可溶性蛋白注射烟草叶片也能引起HR。抗病性试验结果表明，转基因烟草对烟草花叶病毒、软腐果胶杆菌及辣椒疫霉都有较好的抗性。RT-PCR分析表明转基因烟草植株中可检测到过敏性反应的标志基因hsr203J和hsr515的表达，同时也能检测到其它重要的防卫反应相关基因PR-1a，chia5，pal以及脱落酸信号通路相关基因ABH1的表达。烟草基因芯片分析发现，转N21基因烟草对未转基因出发烟草有2666个差异表达基因，其中上调基因1204个（ratio>2.0），下调基因1462 个(ratio<0.5)。2666个差异表达基因主要涉及10类分子功能、9类细胞组分、21类生物过程和20个代谢通路。采用亲和层析（AC）的方法从烟草质外体液中筛选到一种受体蛋白分子，经HPLC纯化、MALDI-TOF MS检测和Mascot串级质谱数据将其鉴定为19.4 KDa光合作用系统II放氧蛋白。在线程序S2Spred和COIL预测发现其多个区域能形成α-螺旋结构，且35-55位氨基酸残基域形成CC结构的可能性较高。根据CC互作的原理，该蛋白的这段区域可能以CC方式与N21多肽进行互作。本项目通过卷曲螺旋多肽的转基因研究和受体分析，对harpin蛋白的功能机制解析具有重要作用。