中文摘要：

流感作为严重威胁公众健康的病毒性传染病，防治形势很不乐观。作用于流感病毒包膜血凝素蛋白的病毒进入抑制剂是抗流感药物研究的热点。双黄连口服液是中医药防治流感的重点推荐药品，但其有效成分，尤其是作用机制明确的有效成分尚不清楚。目前, 生物色谱法已成为中药复杂体系中有效成分分析的有效方法。本研究拟采用血凝素蛋白偶联色谱和鸡红细胞膜色谱技术，结合液相色谱-质谱联用技术，分离双黄连口服液中能与血凝素蛋白和鸡红细胞膜结合的小分子化合物，并确证其结构，分析其抗流感活性及作用机制，旨在发现双黄连口服液中能抑制流感病毒进入靶细胞的活性化合物。同时，对组方药材中与抗流感密切相关的效应成分进行跟踪研究，深入揭示双黄连口服液抗流感的药效物质基础。本研究从化学和生物活性角度为双黄连口服液抗流感病毒的物质基础提供科学依据，有望从流感防治中药中发现新机制的小分子抗流感药物，对于中药现代化具有重要意义。

结论摘要：

流感作为严重威胁公众健康的病毒性传染病，防治形势很不乐观 。作用于流感病毒包膜血凝素蛋白的病毒进入抑制剂是抗流感药物研究的热点。双黄连口服液是中医药防治流感的重点推荐药品，但其有效成分，尤其是作用机制明确的有效成分尚不清楚。目前, 生物色谱法已成为中药复杂体系中有效成分分析的有效方法。本项目建立了鸡红细胞膜生物色谱快速分离鉴定双黄连口服液中活性单体化合物的新技术；避免了常规分离方法大量分离纯化有效化合物的麻烦，极大地提高发现抗病毒中药物质基础的过程。我们检测了不同亲合力的单体化合物抗H5N1禽流感的活性，发现了双黄连口服液中能与鸡红细胞膜结合的4个小分子化合物。随后，分析了绿原酸、黄芩素、黄芩苷、槲皮素抗流感活性及作用机制，结果发现均能特异性作用于H5N1假病毒的进入环节。对槲皮素抗流感活性及作用机制研究发现其靶点为血凝素蛋白的HA1和神经氨酸酶, 且对甲型流感病毒A/FM-1/47具有抑制作用，IC50 为17.29 ± 1.94 μg/ml。更为重要的是，槲皮素能够显著抑制病毒所导致的IL-6, IL-8, TGF-β, MyD88和RANTES等细胞因子的升高，且对病毒产生的自噬产生重要影响，可作为双功能的抗流感药物进行开发。 另外，我们利用本项目实施过程中所建立的抗流感病毒药物活性筛选平台和天然药物分离纯化平台，建立了大规模筛选小分子病毒进入抑制剂的H5N1假病毒方法。结合所建立的鸡红细胞膜生物色谱技术分离得到茶黄素衍生物、EGCG具有明显抑制H5N1禽流感病毒进入靶细胞的活性。 本研究采用鸡红细胞生物色谱技术为双黄连口服液抗流感病毒的物质基础提供科学依据，有望发现具有自主知识产权的天然来源小分子流感病毒进入抑制剂，开发了新机制的抗流感药物，对于中药现代化具有重要意义。