中文摘要：

生物催化法制备核苷类中间体具有立体选择性高、反应步骤简单、条件温和、污染少和成本低的优点，是解决我国核苷类药物规模化生产瓶颈强有效途径之一。但生物合成法中全细胞催化剂的重复使用一直是困扰其应用的难点。本项目首次采用酵母表面展示技术，将参与反应的嘌呤核苷磷酸化酶、尿苷磷酸化酶和胸苷磷酸化酶通过絮凝素锚定于酵母细胞壁，同传统固定化技术相比，不仅达到了回收方便、寿命长、重复使用的优点，更保持了酶的空间结构和稳定性等优良特性。通过探讨采用所构建的核苷磷酸化酶酵母表面展示系统在制备重要核苷类医药中间体反应中催化活性和稳定性的变化规律，进一步阐明核苷磷酸化酶对含有嘌呤和嘧啶不同底物催化特性和调控机制，完善核苷类似物生物催化的理论体系与方法，达到制备出催化效率更高，成本更低，底物适应性更广的核苷类似物制备专用全细胞催化剂的目的。

结论摘要：

2'-脱氧腺苷，2'-脱氧尿苷和5-甲基尿苷等是生产核苷类药物关键中间体，目前主要采用化学合成法制备。生物催化法具有立体选择性高、反应步骤简单、条件温和、污染少和成本低的优点，本课题分别构建了嘌呤核苷磷酸化酶、尿苷磷酸化酶和胸苷磷酸化酶原核生物和真核生物表达系统以及共表达系统，成功构建了三种磷酸化酶酵母表面展示系统，研究了它们在制备重要核苷类医药中间体2'-脱氧腺苷， 5-甲基尿苷等反应中催化活性和稳定性的变化规律，探讨了底物浓度、菌体量、温度、金属离子种类等对核苷磷酸化酶全细胞生物催化转化率影响，进一步完善了核苷类似物生物催化制备工艺与方法。