中文摘要：

Anticalin（抗体类似物）目前在国内外的农业、环境、食品等领域中均未见研究报道。鉴于Anticalin所呈现的潜在优势和小分子有害物残留免疫快速检测中的瓶颈问题，选择二噁英、克百威、氯霉素等多种毒性大、危害重的小分子有害物为研究对象，以天然小分子受体蛋白Lipocalin为骨架蛋白，采用PCR诱变法和噬菌体表面呈现技术构建高容量随机突变肽库，筛选其特异性识别分子Anticalin，分析比较它们的亲和力、特异性和稳定性等应用性能，对部分未达质量要求的有害物识别分子进行体外分子改造，最终获得3种以上的高亲和力和高特异性的有害物识别分子Anticalin。由于Anticalin在制备方法、时间、成本等方面比抗体占明显优势，本研究一旦取得突破，将对小分子有机物快速检测产生重要而深远的意义。

结论摘要：

鉴于Anticalin所呈现的潜在优势和小分子有害物残留免疫快速检测中的瓶颈问题，本课题首次以小分子农药克百威，违禁兽药盐酸克伦特罗、渔药氯霉素等为研究对象，开展了小分子有害物的特异性anticlin的筛选及特性研究。结果如下1)建立了上述3种违禁药物筛选系统。2)依据大菜粉蝶lipocalin蛋白家族中的BBP蛋白基因序列，设计引物，重叠延伸扩增出BBP蛋白保守区和突变区基因片段，大小分为250bp和371bp，重组到噬菌粒载体pCANTAB5E中构建lipocalin突变文库，库容达4.0×109。3)采用柱式和平皿式交叉使用对文库筛选，经3轮筛选，得到克隆K7 与克百威能特异结合，经2轮筛选，得到2个噬菌体克隆与克伦特罗有结合活性；4)完成克百威特异性anticalin的可溶性表达，SDS-PAGE显示其分子量约为22.0kDa，Western-blotting检测其与HRP-抗E-tag标签抗体特异性结合。5)通过构建重组表达载体pBV220-cbf，优化优化工程菌发酵条件，表达量达30.1％，分离纯化获得具活性的克百威特异性anticalin，纯度>98%,蛋白回收率45％。