中文摘要：

杜兴肌肉萎缩症是一种系统性的肌肉退化疾病，由编码抗肌萎缩蛋白-dystrophin的DMD基因突变，导致dystrophin缺失所引起。最近反义寡核苷酸介导的外显子跳读的基因治疗方法在杜兴肌肉萎缩症的临床试验中显示出巨大的应用前景。但目前临床测试的反义寡核苷酸药物存在着系统诱导外显子跳读效率低、用药量大和在心肌中诱导dystrophin蛋白表达量有限等问题。其中心肌肥大失调是导致杜兴肌肉萎缩症病人死亡的主要原因之一。为进一步提高反义寡核苷酸在肌肉，特别是心肌中的靶向运输和诱导外显子跳读效率，本项目将利用噬菌体展示技术来筛选和鉴定新的心肌和肌肉特异性短肽。将筛选到的新型特异性短肽与寡核苷酸药物结合，利用杜兴肌肉萎缩症小鼠模型来测试其肌肉、心肌靶向性运输和诱导外显子跳读的效率，并对其作用机理进行阐释。这些研究将为杜兴肌肉萎缩症的治疗提供新的候选药物，并为新一代药物的设计提供指导作用。

结论摘要：

杜兴肌肉萎缩症是一种系统性的肌肉退化疾病，由编码抗肌萎缩蛋白-dystrophin的DMD基因突变，导致dystrophin缺失所引起。反义寡核苷酸介导的外显子跳读的基因治疗方法在杜兴肌肉萎缩症的临床试验中显示出巨大的应用前景。但目前临床测试结果显示此类药物存在着系统诱导外显子跳读效率低、用药量大和在心肌中诱导dystrophin蛋白表达量有限等问题。为进一步提高反义寡核苷酸在肌肉，特别是心肌中的靶向运输和诱导外显子跳读效率，本项目计划是利用噬菌体展示技术来筛选和鉴定新的心肌和肌肉特异性短肽。将筛选到的新型特异性短肽与寡核苷酸药物结合，利用杜兴肌肉萎缩症小鼠模型来测试其肌肉、心肌靶向性运输和诱导外显子跳读的效率。我们基本按原定计划开展了研究工作，首先利用噬菌体文库在C2C12细胞中进行体外淘选，将筛选到的噬菌体分别进行测序，将测序结果中重复率高的短肽作为筛选肌肉靶向候选短肽。候选噬菌体进行体内分布验证和对各组织中噬菌体进行免疫组化验证肌肉靶向性。合成荧光标记候选靶向肽M12，利用小动物成像技术来检测候选短肽在动物体内的分布情况，经过体外和体内验证C2C12筛选到的短肽M12具有肌肉靶向性。将候选短肽M12与PMO药物连接后进行了功能验证，在mdx小鼠模型中的结果显示效果比以前报道的肌肉特异性短肽（MSP）的效果都有显著提高dystrophin蛋白在全身骨骼肌的恢复达到了25%，相应的抓力也得到恢复，而MSP-PMO或者PMO单独用药dystrophin蛋白不到2%。并且在使用高剂量的时候75mg/kg，也不存在毒副作用。在获得候选靶向肽的同时，我们建立心肌切片平台来筛选心肌靶向肽，目前噬菌体体内分别和合成标记短肽的体内分布实验结果，都证明已筛选到心肌靶向的候选短肽，该部分结果仍在实验中。本项目获得了更为高效的肌肉靶向短肽M12，为杜兴肌肉萎缩症的治疗提供新的候选药物M12-PMO。本项目取得研究成果有以下申请国家发明专利1 项；在国内外刊物上发表相关论文5篇，其中高水平SCI收录论文3 篇。在本项目研究成果的基础上，课题负责人王青松老师顺利博士后出站；获得天津市“131”创新型人才培养工程第三层次人才；王青松老师在2014年获得国家自然基金面上基金资助；项目成员曹海龙、时文涛和高先军老师都获得了国家自然科学基金青年基金，高先军老师获得天津市的青年项目资助