中文摘要：

杜兴肌肉萎缩症是一种最常见的、致死性遗传神经肌肉失调症，其原因是DMD基因突变导致其编码的抗肌萎缩蛋白dystrophin缺失，造成肌肉萎缩、心肌肥大失调直至死亡。最新研究结果表明，通过反义寡核苷酸介导外显子跳读的基因治疗方法可以恢复dystrophin在肌肉中的表达，为杜兴肌肉萎缩症的治疗提供了一条新途径。然而目前测试的反义寡核苷酸药物存在着系统运输效率低、用药量大及在心肌中无dystrophin表达等问题。为此，我们广泛筛选了运输辅助剂和短肽，发现细胞穿梭肽可以提高反义寡核苷酸在肌肉中的运输效率，同时首次鉴定到了一系列高效的心肌特异性短肽。本研究拟在大量的前期工作基础上，利用杜兴肌肉萎缩症小鼠模型和心肌活体切片等技术对这些短肽及其修饰的反义寡核苷酸进行深入系统的功效和机理研究。这些研究将为杜兴肌肉萎缩症及其相关疾病的临床基因治疗起到重要的指导作用。

结论摘要：

杜兴肌肉萎缩症（DMD）是一种最常见的致死性神经肌肉失调症，由dystrophin蛋白缺失导致，目前临床上未有任何有效的治疗方法。最近反义寡核苷酸介导外显子跳读治疗方法，在临床试验中显示出巨大的应用前景。然而临床测试的反义寡核苷酸药物存在系统效率低、用药量大和在心肌中作用有限的问题。在前期工作中，我们筛选到一系列新型心肌靶向肽，通过与反义寡核苷酸PMO共价耦合，可以显著提高反义寡核苷酸药物系统运输效率，特别是在心肌中诱导dystrophin蛋白恢复的能力。为进一步发掘这一新型心肌靶向肽在DMD上的应用潜力，在本项目中，我们利用DMD小鼠模型 - mdx，对心肌靶向效果最佳候选肽-Pip5e展开全面系统的研究，包括不同给药途径、剂量和给药周期测试，并对相关的毒副作用进行分析。同时，利用年老mdx小鼠，对 Pip5e能否改善小鼠心肌功能展开研究。为阐示Pip5e作用机理，我们对其运输途径和组织分布等进行剖析；另外，通过氨基酸突变方法，对其核心氨基酸进行解析，以确定关键功能区。为测试Pip5e与肌肉靶向肽相结合的协同效应，我们将Pip5e和MSP与PMO共价结合进行测试。结果表明尾静脉给药是最有效的给药途径，优于腹腔给药；在剂量研究中，高剂量的作用效果显著优于低剂量，表现出剂量效应，其中以25mg/kg单次尾静脉注射效果最佳；在给药周期试验中，我们发现多次重复尾静脉注射效果显著优于单次注射，表现出累加效应，但在心肌中区别不明显；在处理组中，未检测到药物相关的毒害作用。在3月龄和6月龄mdx小鼠心脏功能试验中，我们发现B-PMO显著改善6月龄mdx小鼠右心室功能，但未能检测到Pip5e-PMO对小鼠心脏的提高作用；在3月龄mdx小鼠中，二者均未能改善心脏功能。通过缺失或缩短Pip5e核心疏水区的突变试验，我们证明其核心疏水区对心肌靶向起关键作用，缺失或缩短这一核心区，Pip5e的心肌靶向性都显著降低。而将肌肉特异性肽MSP与Pip5e或（RXR）4相结合，未能显著提高Pip5e的肌肉靶向性和运输效率。对Pip5e运输途径和作用机理的研究结果显示其高效心肌靶向性部分归因于其提高PMO入核能力。本研究为DMD基因治疗提供了一种新的候选药物，对其作用机理和结构的剖析为优化Pip5e设计提供了理论依据。尤为重要的是，本研究为其他心心肌相关疾病的治疗提供了一条崭新的途径。