中文摘要：

先天性心脏病是胚胎时期心血管系统发育异常所致的出生缺陷，现已明确转录因子的基因多态可通过改变基因表达量参与先天性心脏病的发生。miRNA可结合基因的3'非翻译区(3'UTR)序列而在转录后水平下调基因的表达。已有报道小鼠模型中心脏发育相关转录因子HAND2、TBX1、MEF2C和GATA4均受到miRNA的调控，但尚未见人群中的研究结果。我们首先通过检测心脏发育相关的人源转录因子TBX1、TBX5、NKX2-5和GATA4 3'UTR的不同基因型在case-control里的分布差异，找到与先天性心脏病相关的风险基因型，接着应用生物信息学、表面等离子共振技术和萤光素酶筛选实验鉴定与这些基因型结合的功能性miRNA，同时结合斑马鱼体内实验，揭示miRNA与转录因子不同基因型3'UTR的结合与先天性心脏病的关系及作用机制，为先天性心脏病的个体化诊断和治疗提供前期研究基础。

结论摘要：

我们首先检测了心脏发育相关核心转录因子TBX1、TBX5、NKX2-5、GATA4和 TBX2 3’UTR的不同基因型在CHD病例-对照里的分布差异，并进行细胞转染和荧光素酶检测初步筛查潜在的功能性位点，随后通过SPR、EMSA、qRT-PCR、Western blot和斑马鱼显微注射等实验发现1）TBX5 3’UTR 位点rs6489956显著增加CHD的风险（病例1177例，对照990例）。与CC基因型相比，CT-TT基因型能提高1.9倍的患病风险 (95% CI = 1.52-2.38, P = 8.79×10-9)。分层分析发现，该位点与多种类型CHD存在关联。荧光素酶报告基因检测结果显示，T等位基因的表达量显著低于C等位基因；SPR实验表明miR-9及miR-30a与T等位mRNA的结合力更强；而T等位型显微注射的斑马鱼较C等位型更易出现心脏畸形，二者间的差异在共注射miR-9或miR-30a后更为显著；此外，我们还发现miR-10a/b可通过结合TBX5 3’UTR在翻译水平负调控其表达；2）TBX1启动子区rs41260844在病例和对照中的等位基因分布频率存在显著差异，其中C为风险位点，CC基因型的发病风险提高1.63倍（95%CI=1.13-2.36，P=6.3×10-3）。同时，该位点作为Tag参与的单倍型（包含3’UTR位点rs41258424）使CHD风险增加2.38倍（95% CI =1.01 - 5.65, P=0.049），且EMSA提示抑制性核蛋白与Minor单倍型的结合力更弱，导致基因表达量上升；3）NKX2-5 3’UTR位点rs703752在病例-对照中的分布频率存在差异（P=0.0022），但并不影响报告基因活性，为非功能位点；4）GATA4 3’UTR常见遗传变异在病例-对照中的基因型分布无明显差异（P>0.05）；5）TBX2 3’UTR位点rs59382073的GT-TT基因型使CHD的患病风险（病例768例，对照660例）增加2.13倍(95% CI=1.51-2.99, P = 1.44×10-5)，且T等位基因可导致荧光素酶活性显著下降。本课题发现了转录因子若干与CHD风险相关的3’UTR位点，初步揭示了miRNAs对转录因子不同基因型3'UTR的差异调控致CHD的机制，为CHD的个体化诊断提供初步依据。