中文摘要：

多种酰基辅酶A脱氢酶缺乏症(MADD)是由于线粒体电子转运黄素蛋白或电子转运黄素蛋白脱氢酶(ETFDH)先天缺陷所致的中国人常见脂肪酸代谢障碍。我们前期对MADD患者ETFDH基因检测发现4种未报道的新错义突变。线粒体突变蛋白的错误折叠及线粒体氧化应激可能是脂肪酸氧化障碍疾病的重要病理机制，本研究拟利用慢病毒系统稳定表达新错义突变ETFDH蛋白于HepG2细胞及患者皮肤成纤维细胞这两种模型，探讨ETFDH新错义突变对酶蛋白活性和稳定性影响，激光共聚焦显微镜观察突变蛋白线粒体定位和形态变化；免疫沉淀、western blot等考察核黄素、mHsp70/Hsp60、泛素蛋白酶体在其折叠和降解中的作用；检测线粒体活性氧、膜电位、抗氧化酶和抗氧化剂及自噬体的形成考察线粒体氧化应激压力，旨在探索ETFDH基因结构与功能关系，阐明线粒体突变蛋白的折叠降解及细胞损伤机制，为今后寻求干预方案提供依据。

结论摘要：

多种酰基辅酶A脱氢酶缺乏症（MADD）是一种中国人最常见的脂肪酸氧化障碍疾病。MADD是由于编码线粒体的电子转运黄素蛋白(ETFA/B基因编码)或电子转运黄素蛋白脱氢酶ETFQO（ ETFDH基因编码）先天缺陷所致。以往关于脂肪酸氧化障碍疾病的致病机制的研究认为线粒体突变蛋白的错误折叠及线粒体氧化应激可能是这一类疾病的重要病理机制。本研究首先明确了42例迟发型MADD患者的基因突变谱，共发现了ETFDH基因45种突变，其中22种为国际上未报道的突变，丰富了中国人MADD基因突变谱，比较了儿童患者和成人患者之间临床表现和生化特点的差异，发现儿童患者临床表现更具有多样性，预后较成人差。其次, 利用患者皮肤成纤维细胞和表达13种ETFDH错义蛋白的293T细胞这两种模型，明确了ETFDH突变对可导致ETFQO酶蛋白活性和稳定性下降，影响程度与突变在酶蛋白所处的位置和结构域有关，进一步通过免疫沉淀、western blot等方面明确了核黄素可增加突变蛋白的稳定性并改善酶活性，发现分子伴侣mHsp70/ Hsp60及泛素蛋白酶体参与了突变的折叠和降解。另外，通过对上述两种细胞模型中细胞内辅酶Q10 水平、线粒体活性氧、线粒体膜电位、相关氧化应激通路基因表达的研究证明了ETFDH错义突变可导致细胞内辅酶Q10水平降低，线粒体活性氧升高和线粒体膜电位降低及相关氧化应激相关基因表达增加，即可使线粒体的氧化应激水平明显增加，而添加辅酶Q10和核黄素可降低线粒体的氧化应激水平。同时进一步通过基因表达谱芯片技术分析了患者与正常对照皮肤成纤维细胞之间基因表达谱差异，发现患者皮肤成纤维细胞中存在代谢重调，脂代谢通路抑制和糖酵解通路活跃，患者细胞的自噬相关基因和蛋白表达增强。最后，通过激光共聚焦和透射电镜观察了患者成纤维细胞的突变蛋白的定位和超微形态变化。总之，本研究从多个角度和层次探索了ETFDH基因结构与功能关系，进一步明确了突变所致的酶活性降低、突变蛋白降解、细胞氧化应激水平升高、自噬等可能参与了MADD的细胞损伤机制。