中文摘要：

新型多肽药物载体的研究对靶向基因治疗理论的突破具有重要意义。本项目利用细胞穿透肽构建高效、高靶向性、高安全性的新型多肽药物载体体系，用配受体亲和性的富集作用和肝癌细胞选择性启动子(AFP启动子)开关提高载体的靶向性，研究TK基因对肝癌细胞的杀伤作用。内容构建含有细胞穿膜肽和肝细胞膜apoE基因的重组子表达成运载体Ⅰ；构建含有TK杀伤基因、AFP启动子和EGFP报告基因的DNA载体Ⅱ。将带正电荷的运载体Ⅰ和带负电荷的DNA载体Ⅱ结合，制备一种新型的双靶向性载体复合物。其中，运载体Ⅰ旨在提高转染效率和肝细胞内的富集度；载体Ⅱ可使杀伤基因在肝癌细胞中特异性表达，使肝癌细胞凋亡或死亡。课题拟在实验中以DNaseⅠ和无细胞血浆分别检验载体复合物的稳定性，以EGFP表达情况检验其转染效率，比较肝细胞和肝癌细胞的凋亡及死亡率来检测双靶向治疗体系杀伤肝癌细胞的作用。是肝癌靶向基因治疗载体研究的新尝试。

结论摘要：

新型多肽药物载体的研究对靶向基因治疗理论的突破具有重要意义。本项目利用细胞穿透肽构建高效、高靶向性、高安全性的新型多肽药物载体体系，用配受体亲和性的富集作用和肝癌细胞选择性启动子(AFP 启动子)开关提高载体的靶向性，研究TK 基因对肝癌细胞的杀伤作用。本项目通过基因工程的手段分别构建、表达和纯化了基因治疗运载体Ⅰ（包括构建不含HSRBD的CPPs表达载体； HSRBD（Hepatocyte Special receptor binding domain）载体rpE-CPPs）和含有肝癌自杀基因的DNA载体和对照载体。进行了基因治疗运载体（HSRBD载体）与DNA载体的结合实验及稳定性实验，双靶向性载体体系转染肝癌细胞的效率研究。主要包括基因治疗运载体与DNA载体复合物的制备、凝胶滞留电泳及r值研究，确定最佳r值为1，CPPs-vector-DNA复合物在无细胞血浆和DNase I中的稳定性研究，检测含运载体复合物的polyplex对肝癌细胞系的转染效率，针对肝癌细胞和肝细胞的特异转染率分别达到80.1%和78.5%，远高于非肝细胞的5.3%和4.3%。检测了目的基因TK在肝癌细胞系中的表达，进行了肝癌细胞生长分析，肝癌细胞凋亡及死亡的检测，CPPs载体转导组对肝癌细胞HepG2的抑制率达到82.1%，高于无TK基因空载体组的2.35%和脂质体转导组的65.3%。建立了鼠肝癌模型，观察了肝癌细胞特异性自杀基因对鼠肝癌的治疗作用。尝试了利用人工构建的脂质体和apoE的复合物作为质粒运载体，对肝细胞和肝癌细胞的转染情况，以及对鼠肝癌模型的治疗作用，TK基因组肿瘤平均体积为928.8 mm3，无TK组平均瘤体积为1057.4 mm3。和加拿大多伦多大学李仁科教授课题组合作，尝试了超声靶向微球携带TK基因和Timp3基因对肝癌细胞和小鼠肝癌模型的治疗作用，TK基因组和TK联合Timp3基因组对肝癌细胞和肝癌肿瘤模型的杀伤作用均优于无TK对照组和单纯Timp3基因治疗组，均取得较好的治疗效果。该项目的开展为肝癌靶向基因治疗提供了有意义的尝试。