中文摘要：

IGF2/H19是最早发现的一对内源印记基因，对胚胎发育具有重要的调节作用。本课题前期研究发现IGF2在生精阻滞型无精子症患者睾丸组织中的表达显著降低，提示印记基因IGF2/H19对精子发生可能也具有重要作用。本项目将(1)分离小鼠各级生精细胞，检测其IGF2/H19的甲基化印记状态和表达特征，揭示IGF2/H19在小鼠正常精子发生过程中的印记模式。(2)建立IGF2超表达和RNA干扰小鼠生精细胞株，阐明IGF2对体外培养的生精细胞的影响。(3)构建IGF2 RNA干扰小鼠模型，分析IGF2对小鼠精子发生的影响。(4)比较IGF2/H19在正常人和生精阻滞型无精子症患者睾丸组织中的甲基化印记状态和表达特征, 确定其对人精子发生的影响及临床意义。如果本假说得以证实，它将作为一种新的精子发生调控机制对睾丸生精阻滞病因学作出重要补充，同时也为探讨男性不育的临床治疗提供一条新思路。

结论摘要：

目的 为了评估IGF2 印记丢失对生精功能的作用和临床意义。方法 将研究对象的睾丸活检组织、少-弱-畸精症的血液组织及小鼠的睾丸组织的DNA 和RNA 经过PCR 扩增和ApaⅠ酶切来决定IGF2 的印记状态。为了验证IGF2 的印记丢失对生精功能的影响，我们通过睾丸输出小管显微注射技术构建了小鼠模型，按照干预的手段分为三种抗体组、pIRES2-EGFP-IGF2 组和空白对照组，再按照干预的时间将其处死，取其睾丸组织。最后通过免疫组化和HE染色检测睾丸中IGF2 的表达水平。结果 我们选取的60 例无精子症患者的睾丸组织中有25 例患者的IGF2 基因的第9 外显子存在ApaⅠ的多态性酶切位点，这些患者中有13 例（52%）存在IGF2的LOI。而选取的对照组中10 例经过去势治疗的前列腺癌患者的睾丸组织有5例有意义，其中有3 例存在印记丢失，两组间没有明显差异（P = 0.3085）。我们选取的24 例非梗阻性无精症的睾丸活检组织中有18 例（75%）的睾丸组织存在IGF2 的高表达，相反，15 例梗阻性无精子症患者中有12 例（80%）存在IGF2的低表达。两组间存在明显的差异（P = 0.00098）。为了进一步研究男性精液参数与IGF2 印记状态的关系，我们选取了74 例少-弱-畸精症患者的新鲜外周血为实验组，10 例生育能力正常的男性新鲜外周血为对照组。通过ApaⅠ限制性酶切法，我们发现实验组中有34 例患者的第9 外显子存在ApaⅠ的多态性酶切位点，其中有28 例（82.3%）存在IGF2 的LOI。而对照组则全部维持正常的印记状态。在构建的小鼠模型中，小鼠睾丸内注射抗体可以引起IGF2 的表达下降，同时睾丸内的精子数也减少。而小鼠睾丸内注射质粒对IGF2 的表达和精子发生均没有影响。结论 我们发现在无精子症患者的睾丸组织和少-弱-畸精症的血液组织中IGF2基因发生了高概率的印记丢失。这个遗传学改变作为一个生物学指标可能有助于男性精液差或男性不育的诊断。而小鼠睾丸内注射抗体可以引起IGF2 的表达下降，同时睾丸内的精子数也减少。这就意味着，维持IGF2 基因生理性的表达才能维持正常的生精功能，高于生理表达量或者低于生理表达量均不利于生精。