中文摘要：

副鸡禽杆菌是鸡传染性鼻炎的病原菌，是危害养鸡生产的重要病原之一。免疫接种是其主要防治措施，但副鸡禽杆菌全菌灭活疫苗缺乏血清型间的交叉保护，而实验感染鸡可以产生对其他血清型菌株的交叉免疫力。并且，田间感染康复鸡对再次感染也有很强的抵抗力。这表明该病原体某些重要抗原的编码基因只在体内表达,某些体内诱导抗原是副鸡禽杆菌重要的交叉保护性抗原成分。本项目拟构建副鸡禽杆菌基因组DNA的噬菌体文库，根据体内诱导抗原技术的原理，筛选获得副鸡禽杆菌体内诱导基因数据。应用生物信息学软件工具分析预测体内诱导抗原的功能；克隆表达并动物攻毒保护试验检测疑似交叉保护性抗原的免疫原性；通过构建体内诱导基因缺失突变菌株，比较与亲本株生物活性的差异,进一步分析该基因的功能，并探讨其编码蛋白的作用。本研究对绘制副鸡禽杆菌体内诱导基因谱、阐明体内诱导抗原的功能具有重要意义。交叉保护性抗原可为副鸡禽杆菌新型疫苗的研究奠定基础。

结论摘要：

副鸡禽杆菌（Avibacterium paragallinarum，Apg）是鸡传染性鼻炎的致病菌，主要引起鸡的生长发育受阻，产蛋量下降，给养鸡业带了相当大的经济损失。病原菌体内诱导基因的研究是探索该病防治措施的重要基础。副鸡禽杆菌侵入宿主后，为了适应体内的环境，会启动一系列基因的表达，这些体内诱导基因有可能是引起疾病的关键基因,有可能作为候选的免疫及药物分子新靶位。本研究首先提取Apg的基因组DNA，用Sau3A I 酶切后回收片段插入到pET系统表达载体中，构建副鸡禽杆菌的全基因组表达文库。应用体内诱导抗原技术(In vivo induced antigen technology ,IVIAT) 的原理，先用IPTG 诱导文库表达蛋白，然后用经体外培养的副鸡禽杆菌菌株和大肠杆菌BL21(DE3)吸附过的鸡副鸡禽杆菌血清对该文库进行初筛和复筛，对筛选得到的阳性克隆提取质粒用T7启动子引物测序，测得的序列在NCBI上比对后确定开放阅读框。结果显示，本实验构建的副鸡禽杆菌基因组表达文库大小为6×103，文库重组质粒含有率大于80%,达到了理论要求。经过筛选、测序和比对本实验最终确定了5个开放阅读框。有一个表达为转运谷氨酰还原酶，一个转录终止因子和荚膜合成域2基因簇，还有两个表达为保守假想蛋白。在此基础上, 以筛选获得的荚膜合成域基因和aroA基因为研究对象构建基因缺失载体，并将该载体分别电转入到A型副鸡禽杆菌野生菌株，通过同源重组获得突变菌株，对突变菌株进行了鉴定和生物学特性分析。结果表明，突变菌株细菌形态未见明显变化，生长曲线提示其生长未受显著影响，但致病能力较低，初步验证了体内诱导抗原的作用。为研究副鸡禽杆菌在宿主体内生存和致病关键基因奠定了基础，也为鸡传染性鼻炎防治研究提供了思路。