中文摘要：

在本室芥菜SVP与FLC体外原核蛋白表达和相互作用已有研究基础上，拟克隆决定芥菜开花信号整合子命运的反式元件编码基因SVP和FLC，分析其MIKC结构域等生物学信息；正确构建诱饵质粒pGBD-FLC与猎物质粒pGAD-SVP并转化酵母进行互作特性研究，载体互换重构质粒pGBD-SVP与pGAD-FLC并再次转化酵母验证，建立基于SVP与FLC互作的酵母双杂体系；同时分别扩增含MIKC结构域的SVP全长编码区及若干个含部分结构域的编码区并构建多个猎物质粒，与诱饵质粒pGBD-FLC共转化酵母筛选能介导SVP与FLC互作的结构域；载体互换酵母双杂验证以及移码突变实验验证，以确证该作用结构域的特异性。这为利用点突变或随机突变鉴定相互作用的氨基酸位点、根据特异性结构域和作用位点开发SVP-FLC蛋白复合物锁定或解聚的新型调控方法、决定开花信号整合子关闭（抑制开花）或开启（促进开花）等研究奠定基础。

结论摘要：

Flowering Locus C（FLC）和SHOTR VEGETATIVE PHASE（SVP）是抑制芥菜（Brassica juncea）开花的两个核心转录因子，能够调节开花时间。在本室芥菜SVP与FLC体外原核蛋白表达和相互作用研究基础上，克隆了SVP和FLC基因，分析了其MIKC结构域等生物学信息；构建诱饵质粒pGBD-FLC与猎物质粒pGAD-SVP并转化酵母进行互作特性研究，载体互换重构质粒pGBD-SVP与pGAD-FLC并再次转化酵母验证，建立了基于SVP与FLC互作的酵母双杂体系。同时分别扩增含MIKC结构域的SVP全长编码区及多个含部分结构域的编码区并构建多个猎物质粒，与诱饵质粒pGBD-FLC酵母双杂，发现SVP依靠K域（含K1、K2和K3亚域）与FLC互作；再次构建FLC的多个突变体，与SVP酵母双杂发现FLC也依靠K域与SVP互作。进一步构建了K域亚域的多个突变体，并基于Gal4酵母双杂交系统和β-半乳糖苷酶活性分析了芥菜FLC与SVP异源互作以及FLC与FLC、SVP与SVP同源互作机制。发现SVP的K1亚域与FLC的K1亚域能异源蛋白互作；SVP的K2亚域可加强该作用，但L2连接区（位于K2与K3之间）有削弱作用，而L1连接区（位于K1与K2之间）和K3亚域对此无影响；FLC的K2亚域也会增强该作用，但K3亚域有削弱作用。SVP同源蛋白互作则需完整K域介导。而FLC同源蛋白互作仅需K1亚域介导，K2、K3亚域均有削弱作用。此外，也克隆了甘蓝FLC基因，并与芥菜SVP酵母双杂交，发现芥菜SVP依靠完整的K域能与甘蓝FLC相互作用，I域能增强该蛋白互作，但M域和C域可能会干扰该作用；当芥菜FLC被甘蓝FLC替换后，可明显增加作用强度。本研究结果为利用点突变或随机突变鉴定相互作用的氨基酸位点、根据特异性结构域和作用位点开发SVP-FLC蛋白复合物锁定或解聚的新型调控方法、决定开花信号整合子关闭（抑制开花）或开启（促进开花）等研究奠定基础。