中文摘要：

VSMC增殖是血管狭窄/闭塞的主要原因，Rb/E2F通路对VSMC增殖起核心调控作用.申请者发现shh与移植血管再狭窄的发生发展关系密切,其机制是通过Rb/E2F1通路促进VSMC增殖,但其具体调控机制及作用方式不清.本申请课题的前期研究证实:在shh过表达VSMC模型中，miR-17表达明显增高,理论预测miR-17与RbmRNA-3'UTR有关键结合位点,提示miR-17可能通过Rb调控VSMC的增殖及血管再狭窄的发生.但调控机制及作用方式均未见报道.本项目拟通过1）Luc和GFP报告基因表达分析，研究miR-17与RbmRNA-3'UTR的直接作用和结合位点；2）在shh过表达及沉默表达VSMC模型中，进行miR-17阻断及过表达干预，研究miR-17对Rb的转录后调控作用，进而探讨shh/miR-17/Rb调控VSMC增殖的协同作用机制。为防治血管再狭窄提供理论与实验依据.

结论摘要：

血管平滑肌细胞的异常增殖诱发血管再狭窄的发生。视网膜母细胞瘤蛋白（Rb）在异常增殖VSMCs细胞中发挥重要作用。为研究Rb蛋白调控VSMCs细胞异常增殖的具体机制，我们首先检测到在异常增殖的VSMCs中Rb蛋白低表达。应用miRNA芯片筛查发现，在Rb蛋白表达差异的VSMCs细胞中，有19种miRNA表达发生显著变化，其中miR-17变化率最大，较对照组升高了7倍；运用Pearson相关分析法分析miR-17与Rb表达的相关性，结果提示二者表达呈负相关。通过生物学软件预测发现miR-17与Rb mRNA 3'-UTR区存在结合位点，同时荧光素酶报告分析及realtime PCR验证了两者直接的靶向结合作用；在VSMCs细胞株中干预miR-17表达后，发现miR-17可以靶向调控Rb蛋白，进而影响与Rb相关的细胞周期蛋白PCNA、E2F1、Cyclin D的表达及细胞周期与增殖的改变。本研究同时考察了内源性调控miR-17的具体机制，应用生物信息学软件预测到NF-κB/p65与miR-17启动子区存在结合位点，荧光素酶报告分析验证了NF-κB/p65蛋白可以直接与miR-17启动子结合，激活NF-κB /p65可以使miR-17的表达增加、Rb蛋白相应出现降低；抑制NF-κB /p65活化则miR-17表达减少，Rb蛋白表达相应升高。综上，我们的研究结果表明，血管平滑肌细胞中上调NF-κB/p65蛋白后，可增强miR-17的转录，进而抑制Rb蛋白的表达，取消了Rb对细胞周期G1/S转导的抑制作用，最终促使VSMCs过度增殖。由于NF-κB/p65信号通路的激活主要受炎症反应调节，故本研究可能揭示了炎症反应中血管平滑肌细胞过度增殖的新机制，为血管再狭窄的治疗提供新靶标。