中文摘要：

氰戊菊酯是一种广泛应用的高效杀虫剂，其残留问题不但威胁着人们的饮食健康，还对我国的出口贸易造成较大影响。由于具有快速、简便、灵活的优点，免疫检测一直是食品安全检测的重要技术，但是受到抗体亲和性的限制，较低的灵敏度已经成为制约该技术发展的瓶颈。本研究以制备氰戊菊酯高活性基因工程抗体为主要目标，首先利用噬菌体展示技术和单克隆抗体技术，制备多种具有理想亲和性和特异性的单链抗体作为初始抗体；在此基础上，利用易错PCR和DNA重排技术构建突变抗体库，从中筛选具有更高活性的氰戊菊酯基因工程抗体，用以建立高灵敏度ELISA检测方法；此外，还将以不同单链抗体为基础，利用生物学软件和晶体结构技术，分析氰戊菊酯与其抗体间的作用机制。本研究的开展，将能够有效改进高活性基因工程抗体制备技术，从而提高小分子物质免疫分析方法的检测能力和应用范围；还将为小分子物质与其抗体间作用机制理论的发展提供基础数据。

结论摘要：

菊酯类农药广泛用于蔬菜、水果、农作物、食用菌、养殖动物的害虫防治。由于使用量大，菊酯类农药的残留已经成为一个严重问题，通过污染自然环境对养殖动物和人类造成较大威胁。此外，这类农药的残留还严重影响了我国茶叶、农作物、蔬菜、水果等物资的出口。因此开展菊酯类农药检测技术与检测机理研究具有重要的意义。本研究制备了氰戊菊酯单克隆抗体、基因工程抗体，并利用随机突变技术制备了突变抗体；在获得抗体关键基因序列的基础上，利用模拟技术获得了抗体的三维结构，并进一步探讨了抗体-抗原的作用机制。具体研究结果如下在计算机辅助设计下，合成了菊酯半抗原，并与载体蛋白连接形成人工抗原；免疫Balb/C小鼠后，通过细胞融合、克隆化，共获得5株特异性较好的杂交瘤细胞克隆；从单克隆杂交瘤细胞扩增获得单链抗体（scFv）片段，构建了库容为2.3e7pfu的M13噬菌体展示抗体库，抗体库的阳性率为100%，同样利用氰戊菊酯免疫后的小鼠脾脏构建了库容为5.16e6 pfu 的抗体库，阳性率为90%；以氰戊菊酯作为配体对抗体库进行淘选，获得2条单链抗体基因，其中细胞来源单链抗体基因编码123个氨基酸的重链可变区、107个氨基酸的轻链可变区，脾脏来源单链抗体基因编码119个氨基酸的重链可变区、108个氨基酸的轻链可变区；将细胞来源单链抗体进行重组表达，获得了分子量约为30 kDa的单链抗体蛋白，对单链抗体活性进行检测，结果显示10 ug/mL的氰戊菊酯对单链抗体的抑制率为24.33%；以该单链抗体基因为模板，利用易错PCR构建了突变抗体库，库容为4.1e7 pfu，阳性率为90%，利用氰戊菊酯对突变库进行淘选，获得了突变单链抗体基因，该基因编码118个氨基酸的重链可变区、109个氨基酸的轻链可变区；将基因进行原核重组表达，获得了分子量约为30 kDa的单链抗体蛋白，对抗体活性进行检测，10 ug/mL的氰戊菊酯对单链抗体的抑制率为30.75%。利用Discovery Studio软件将单链抗体与氰戊菊酯分子进行对接，结果显示单链抗体与氰戊菊酯能够较好的结合，细胞来源抗体结合区域由重链CDR2、CDR3、轻链CDR3的部分氨基酸构成，脾脏来源抗体由重链CDR3、轻链CDR2和轻链框架区III的部分氨基酸构成。本研究的开展，对小分子危害物免疫检测技术的发展与免疫机理的阐明起到了推动作用。