中文摘要：

由于绿藻氢酶的活性是光合细菌和蓝藻中氢酶活性的100多倍, 所以绿藻光合放氢是最具有应用前景的生物制氢途径。然而，绿藻氢酶受光合放氧的抑制, 使得其持续放氢时间只有几秒到几分钟。研究发现缺硫胁迫处理后, 绿藻持续放氢时间可达70小时，其藻细胞产氢效率大大提高。目前对这一现象的生理生化过程进行了深入研究，但其分子调控机制还不清楚。申请者研究发现miRNAs参与了莱茵衣藻应答缺硫放氢过程的调控，为探讨硫胁迫下绿藻持续放氢的分子调控机制提供了新的思路。本项目拟以单细胞真核绿藻-莱茵衣藻作为实验材料，通过分析莱茵衣藻应答硫胁迫放氢过程中miRNAs的表达谱,筛选参与调控硫胁迫放氢过程的特征miRNAs，预测并验证其靶基因。通过对藻细胞特征miRNAs进行正负调控，研究其在莱茵衣藻应答硫胁迫放氢过程中的调控功能，为进一步探讨绿藻生物光合制氢的分子调控机制提供重要的理论依据。

结论摘要：

由于绿藻氢酶的活性是光合细菌和蓝藻中氢酶活性的100多倍, 所以绿藻光合放氢是最具有应用前景的生物制氢途径。然而，绿藻氢酶受光合放氧的抑制, 使得其持续放氢时间只有几秒到几分钟。研究发现缺硫胁迫后, 绿藻持续放氢时间可达70小时。为了探讨莱茵衣藻缺硫放氢的机制，本研究对莱因衣藻缺硫放氢过程中的调控miRNAs及其功能进行了研究，具体结果如下（1）利用深度测序和荧光定量PCR技术，对正常培养和缺硫培养的莱茵衣藻小RNA库进行分析，结果发现①莱茵衣藻的小RNA长度主要分布在20nt-25nt，主要定位在莱茵衣藻第3、7、10、13号染色体的正链上以及莱茵衣藻第1、2、9号染色体的负链上；②莱茵衣藻在缺硫培养环境下，小RNA的组成有了很大的改变，siRNA的表达量基本保持稳定，而miRNA的表达量有着显著的提升；③比较硫培养和缺硫胁迫下的莱茵衣藻miRNAs表达谱，筛选到47个衣藻miRNA参与莱茵衣藻缺硫胁迫调控。这些调控miRNAs分别涉及到脂代谢、蛋白水解、光合作用、碳代谢、转位子和转运体、DNA和RNA转录翻译、嘌呤和嘧啶代谢、氨基酸代谢和激酶磷酸化代谢等众多的代谢途径。（2）采用双向电泳和质谱技术相结合的方法，分析缺硫胁迫对莱茵衣藻蛋白表达水平的影响，发现12个有明显表达差异的蛋白质；对OEE2基因进行了荧光定量PCR检测，结果发现OEE2基因在缺硫培养72h后，表达量下调至正常培养的16.6%。 （3）以OEE2基因为靶点，采用高丰度莱茵衣藻cre-MIR1162的前体，构建人工microRNA表达骨架；并插入到pH124中构建人工microRNA的表达载体，转入到莱茵衣藻并筛选到高效表达人工microRNA的转基因藻株。（4）利用WATER- PAM、GC等分析手段对莱茵衣藻对照组和转基因藻株的光合活性及光合放氢水平进行分析，发现通过诱导表达人工microRNA，可使转基因藻株的PSⅡ系统受到抑制。使转基因藻株单位产氢量比对照提高四倍以上。（5）利用构建过表达内源miRNAs的转基因藻株，对筛选的缺硫产氢调控miRNAs进行功能分析，发现microRNA1166.1是衣藻产氢非常重要的调控miRNA。本项目的研究结果为阐述绿藻缺硫放氢的机制提供了重要的证据，为进一步开发绿藻生物光合制氢生物反应器提供了重要的理论基础和新的技术途径。