中文摘要：

诱导动物体细胞重编程研究为当今生物科学领域的热点之一，近年来在小鼠、猪和人等获得重大突破。但是尚未见到有关绵羊的相关研究报道。已有研究表明，利用小鼠等异源动物iPS诱导因子可以诱导猪、人等体细胞为iPS。本研究拟利用小鼠 、猪或人的诱导因子及在前期工作中克隆的绵羊Sox2、Klf4和lin28基因，构建逆转录病毒载体并包装成病毒颗粒后，通过不同诱导因子组合或同时添加 "5-氮杂胞苷"等小分子物质后侵染分离培养的绵羊成纤维细胞；与此同时，改良小鼠和人ES培养基，筛选适合用于绵羊iPS诱导的培养基；采用逐步消化筛选法分离iPS细胞，在检测该细胞的生长特性和标志性基因表达的基础上，揭示多能性基因启动子的甲基化与诱导iPS的相关性，确定绵羊成纤维细胞重编程的特点，最终建立诱导绵羊体细胞重编程的新方法，为进一步开展绵羊iPS的相关研究奠定基础。

结论摘要：

摘要: 诱导动物体细胞重编程研究为当今生物科学领域的热点之一，近年来在小鼠、人和猪等物种获得重大突破。但绵羊的相关研究进展缓慢。为探明绵羊来源及异源诱导因子能否诱导绵羊体细胞为多能干细胞，本研究做了如下主要工作1）从100d左右胎羊皮肤分离获得成纤维细胞系，检测了其生长曲线、群体倍增时间及染色体核型等；2）从胎羊皮肤、小肠等组织分别克隆了绵羊多能性诱导因子（Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc），在对比各因子CDS序列及氨基酸序列与其他物种间的同源性的基础上，分析了各因子的主要功能域；3）分别构建绵羊诱导因子的逆转录病毒载体pMXs-SSox2、pMXs-SOct4、pMXs-SKlf4和pMXs-Sc-Myc，各载体分别和VSV-G载体转染293GP细胞，将病毒上清分别感染绵羊成纤维细胞，检测结果表明各病毒具有侵染靶细胞的能力；4）克隆约1200bp的绵羊Oct4启动子，启动子能带动GFP在小鼠ES细胞中表达；5）检测绵羊成纤维细胞多能性基因启动子的甲基化水平，Oct4、Sox2和Nanog分别为53.9%、73.4%和48.0%；6）利用绵羊各诱导因子可以将小鼠成纤维细胞诱导为多能干细胞，具有ES细胞的形态、碱性磷酸酶阳性并表达多能性基因；7）利用小鼠、人或绵羊诱导因子均可使绵羊成纤维细胞出现克隆样群落，并表达AP，但很难对其传代和继代培养，多能性基因启动子检测表明甲基化水平没有发生显著改变。本研究揭示了多能性基因启动子的甲基化与诱导iPS 的相关性，确定绵羊成纤维细胞重编程的特点，为进一步开展绵羊iPS的相关研究奠定基础。完成本项目期间，发表相关论文11 篇，已接收论文3篇，余下结果正在进行论文撰写论文和投稿。此外，共培养6名硕士生，其中5名硕士生已通过答辩获得相应学位。