中文摘要：

已有研究证实动物雄性生殖干细胞（mGS）在适宜条件下能转化为具有胚胎细胞（ES）特性的多潜能细胞；印记基因甲基化状态及其稳定性对多潜能细胞分离建系具有重要作用，而在猪的研究还是空白。本研究拟用1~2月龄猪睾丸为材料，通过"两步法"消化睾丸组织，通过差速贴壁和免疫磁珠分选富集纯化猪mGS细胞并进行体外培养；将猪mGS转移至特定培养条件培养，使其转化为猪类ES细胞，利用免疫组化、RT-PCR检测细胞的标志分子表达谱、体内外分化潜能；采用甲基化敏感限制性内切酶和甲基化特异PCR（MSP）分析睾丸组织、猪mGS和猪类ES细胞的印记基因和多潜能性关键基因启动子区甲基化状态，阐明印记基因甲基化状态在猪mGS转化为类ES细胞中的作用，为转基因猪研究、猪精子生成、猪种资资源保存提供新的材料和途径。

结论摘要：

人和小鼠的研究已经证实源于睾丸的雄性生殖干细胞（Male germline stem cells, mGS）可转化为类胚胎干细胞（Embryonic stem cells, ES），而ES细胞和mGS细胞未分化状态和分化潜能与其印记基因甲基化模式密切相关。本项目研究可为猪转基因操作、新基因发掘和功能研究、细胞分化和精子发生等研究提供研究模型和材料。项目在执行期间（2012.01- 2015.12）获得了如下研究结果1、性成熟前猪睾丸发育结果显示从出生到3月龄睾丸发育主要是体细胞（包括间质细胞和支持细胞）增殖，2月龄内曲细精管内生殖细胞为性原细胞或未分化精原细胞，至3月龄出现精母细胞；出生至3月龄生殖细胞先定植于基膜，随分化又移向管腔；PGP9.5阳性细胞为睾丸曲细精管内的性原细胞和精原细胞，随分化其表达水平降低，精母细胞至精子均不表达，表达PGP9.5的mGS细胞在出生后1月龄内数量变化不显著，1月龄至3月龄数量显著增加，3月龄后基本稳定。2、猪mGS细胞主要调控因子的分析GDNF、EGF、bFGF、CSF1、LIF在出生后4日龄至2月龄猪睾丸均表达，GDNF和bFGF随日龄增加表达下调，LIF随日龄增加表达上调；CSF1在猪睾丸间质组织和管周肌样细胞强阳性表达但支持细胞不表达，CSF1受体在猪睾丸间质组织和曲细精管内性原细胞和精原细胞中表达，管周肌样细胞不表达。3、免疫荧光分析性成熟前猪睾丸甲基化水平，结果显示睾丸间质甲基化水平显著显著高于曲细精管，曲细精管和间质区域中的甲基化水平以60日龄最高，14日龄最低，14日龄至60日龄依次显著升高；印记基因H19、PEG10、PEG5、IGF2r、DIRAS3、MEG3在所有日龄睾丸组织表达，MEG3和IGF2r随日龄趋向升高而PEG10趋向降低，PEG5和DIRAS3先降低后升高。4、明确了体外条件下，视黄醇（1μmol/L）上调Nanog基因表达和抗凋亡提高人源脐带间充质干细胞增殖活力，连续传代可维持其标志抗原表达；从3-5周龄猪睾丸分离支持细胞，添加视黄醇诱导支持细胞凋亡而使细胞增殖活力和细胞因子合成能力降低，其抑制效应呈现时间和剂量依赖性。5、采用MeDIP测序方法获得了性成熟前（1月龄、2月龄和3月龄）猪睾丸基因组DNA甲基化数据（190M以上），共发现43642个CpG岛，大部分位于基因间区。