中文摘要：

利用RNA病毒系统侵染的寄主组织中能够制备获得高含量病毒基因组双链RNA和双链RNA相对稳定的特征，在纯化的双链RNA两端分别连接人工合成的DNA接头，使用互补单引物进行RT-PCR扩增，获得全长cDNA，进行基因克隆和测序，以快速获得病毒基因组的全序列并确定其末端精确结构，进而分析基因编码特征。结合病毒基因组的侵染性克隆构建和寄主生物学反应测定，确定新病毒的分类学地位和生物学特征，以及病毒变异的株系特征。进一步对新病毒和病毒变异株的发生危害进行系统研究，达到国际病毒分类与命名委员会的认定要求。本项目利用分子生物学最新进展，建立快速精确测定病毒基因组全序列的新方法，快速鉴定大量新病毒和双链RNA因子，为发现新的RNA病毒、亚病毒RNA复制因子、提高发现和控制新病毒和新病毒变异株的研究能力开创新的技术和理论条件。

结论摘要：

在纯化的双链RNA两端分别加上人工合成的DNA接头，使用互补单引物进行RT-PCR扩增，获得全长cDNA以快速获得其全序列。选择黄瓜花叶病毒（CMV）及其卫星RNA（satRNA）系统侵染的寄主组织中制备的dsRNA，3350bp，3050bp，2200bp和369bp，作为实验材料，进行了接头ssDNA与靶dsRNA连接效率、RT-PCR扩增条件等的优化，并进行了接头和扩增引物的优化，提高了dsRNA扩增效率。比如，靶dsRNA与接头的6个摩尔比， 1:1；1:5; 1:10, 1:20, 1:50均能获得目标片段的扩增，其中1:10～1:20的扩增效果更好；300bp~3kb大小的dsRNA均容易扩增获得全长cDNA。在优化克隆测序方法的基础上，进一步对来自天南星科植物病毒的CMV、萝卜、玉米、报春花、蚕豆等自然感病的未知病毒和病毒株进行了克隆和新病毒检测。发现了我国萝卜上两种新的潜隐病毒的复合侵染，确定了RasR1～6的全长序列；此外，在报春花等植物上发现了多个新病毒。本项目结果为研究dsRNA病毒基因组功能及ssRNA病毒突变体打下了基础。