中文摘要：

牙周炎是菌斑微生物与宿主免疫反应相互作用所致的牙周组织炎症性疾病。牙槽骨破坏是其重要病理特征，是造成牙齿松动和脱落的直接原因。牙周炎骨缺失的重要原因之一是成骨细胞数量减少所致的新骨合成降低。慢性牙周炎主要致病菌牙龈卟啉单胞菌产物牙龈蛋白酶诱导多种牙周组织细胞凋亡，由Bcl2家族促凋亡蛋白介导。然而牙龈蛋白酶是否引起成骨细胞凋亡尚未见报道，我们的实验结果显示牙龈卟啉单胞菌的上清液可引起成骨细胞凋亡，Bcl2家族促凋亡蛋白介导血清饥饿引起的成骨细胞凋亡。在此基础上本课题将(1) 建立牙龈蛋白酶诱导成骨细胞凋亡的细胞模型；(2)确定Bcl2家族促凋亡蛋白在牙龈蛋白酶诱导成骨细胞凋亡中的作用；(3)通过明确调控Bcl2家族促凋亡蛋白表达的机理，探讨抑制成骨细胞凋亡的保护机制。本研究结果将为阐明牙龈蛋白酶所致的成骨细胞凋亡的分子机制提供科学依据，为临床治疗牙周炎、促进牙周组织修复重建提供理论指导。

结论摘要：

牙龈卟啉单胞菌是牙周炎的主要致病菌之一，其分泌的牙龈蛋白酶是主要毒力因子，至少提供85%的蛋白水解活性，可诱导牙龈上皮细胞、牙龈成纤维细胞凋亡，并与Bcl2家族参与的内在凋亡通路相关。成骨细胞凋亡影响牙槽骨修复重建的能力，加重骨丧失，因此本课题通过建立牙龈蛋白酶诱导成骨细胞凋亡模型，探讨Bcl2家族在成骨细胞凋亡中的表达、作用及调节，为保护成骨细胞、促进骨修复提供理论依据。首先通过丙酮沉淀牙龈卟啉单胞菌P.g W83上清，经重悬、透析、超滤提取牙龈蛋白酶后，10%凝胶SDS-PAGE分离的牙龈蛋白酶50kDa条带，经基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱/源后衰变（MALDI-TOF-MS/PSD）鉴定其为Rgps。分别用特异性底物BAPNA、ALNA检测Rgps活性为62.84-83.78U/L，Kgp活性为9.27-39.40U/L, 牙龈蛋白酶抑制剂TLCK可完全抑制Rgps和Kgp的活性。牙龈蛋白酶能时间依赖性和剂量依赖性抑制成骨细胞增殖和诱导成骨细胞凋亡，伴随着caspase-3活性及促凋亡蛋白Bim、Bad、Bid表达的升高，而促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xl表达无明显改变。牙龈蛋白酶抑制剂TLCK能有效抑制牙龈蛋白酶所诱导细胞凋亡及Bim、Bad、Bid高表达。 siRNA特异性抑制成骨细胞Bid的表达后，逆转牙龈蛋白酶诱导的细胞凋亡，说明Bid介导牙龈蛋白酶诱导成骨细胞凋亡。Bid存在多种水平调节，牙龈蛋白酶上调Bid mRNA、蛋白及活性形式（tBid）的表达。转录因子p53正向调节Bid的表达，牙龈蛋白酶上调p53表达及活性，而抑制p53的表达及转录活性后，逆转牙龈蛋白酶诱导的Bid mRNA高表达。同时，促存活通路ERK和PKB参与牙龈蛋白酶诱导的成骨细胞凋亡，牙龈蛋白酶下调p-ERK、p-PKB的表达。抑制ERK、PKB活性后，p53、p-p53蛋白表达及Bid mRNA表达均上升，而联合使用抑制剂及牙龈蛋白酶，则p53、p-p53及Bid 的表达没有进一步上调，说明牙龈蛋白酶抑制ERK、PKB活性，上调p53、Bid，激活caspase-3诱导成骨细胞凋亡。生长因子BMP-7及血小板血浆PRP可逆转牙龈蛋白酶的增殖抑制，及减少成骨细胞凋亡，有效的保护成骨细胞。