【目的】为了控制烟草疫霉(Phytophthora nicotianae)引起的烟草黑胫病对烟草生产造成的危害。【方法】采用稀释平板法从贵州省毕节地区烟草根际土壤中分离筛选拮抗烟草疫霉的细菌菌株,然后经形态观察、Biolog鉴定及16S rRNA基因序列分析,对分离菌株进行鉴定,同时测定抗菌谱,单因子变量分析、优化生长条件。【结果】共分离得到44株拮抗烟草疫霉的细菌菌株,其中菌株21b对烟草黑胫病菌菌丝生长的抑制率达78.33%,鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。该菌株对烟草青枯病菌(Ralstonia solanacearum)、烟草灰霉病菌(Botrytis cinerea)、烟草赤星病菌(Alternaria alternate)和烟草炭疽病菌(Colletotrichum destructivum)均具有拮抗作用,抑菌圈大小分别为19.5、18.2、14.6和13.4 mm,最佳的发酵条件为:温度30°C、p H 7.0–8.0、装液量12%、盐浓度0.5%。【结论】分离筛选到一株对烟草寄生疫霉有较强拮抗活性的细菌菌株,为进一步开发烟草黑胫病的生防菌剂提供了菌种资源。